Congelamento de Embriões

Utilizado quando há embriões excedentes de excelente qualidade, após um ciclo estimulado de Fertilização in Vitro (FIV). Geralmente para evitar uma estimulação ovariana futura e nova aspiração de óvulos.

Quanto maior o número de óvulos produzidos em um ciclo de FIV, maiores serão as chances de sucesso no tratamento. Porém, quanto maior o número de óvulos, maior pode ser o número de embriões excedentes, que não poderão ser simplesmente descartados. É um ponto importante que deve ser discutido com o casal em tratamento, já no início do processo: qual será o destino dos embriões excedentes? Porque ás vezes, por questões pessoais, morais e até religiosas, os casais podem não querer ter embriões excedentes no tratamento.

A nova resolução (CFM 2.013/2013) do Conselho Federal de Medicina, permite três destinos para os embriões excedentes:

1) O congelamento dos embriões para o próprio uso futuro, podendo ser descartados após 5 anos, com o consentimento do casal.

2) Doação dos embriões excedentes para casais que necessitem, seguindo as normas do Conselho Federal de Medicina – parágrafo IV – que fala sobre doação de gametas e embriões.

3) Doação dos embriões excedentes para pesquisa em células-tronco embrionárias, conforme Lei de Biossegurança de 2005.

Criopreservação de Gametas ou Embriões

O processo de congelamento de um embrião consiste em uma desidratação, com objetivo de perder água para evitar a formação de cristais de gelo no seu interior. Isso evita o aumento da pressão no citoplasma do embrião, evitando assim, a ruptura (degeneração) durante o procedimento. A partir daí, os embriões passarão por temperaturas cada vez mais baixas, em nitrogênio líquido, até chegarem a -196 ºC, quando poderão ser mantidos por tempo indeterminado. Existem casos de nascimentos de embriões mantidos durante 21 anos em nitrogênio líquido.

Como funciona o processo

1 - As clínicas, centros ou serviços podem criopreservar espermatozoides, óvulos e embriões e tecidos gonádicos.

2 - O número total de embriões produzidos em laboratório será comunicado aos pacientes, para que decidam quantos embriões serão transferidos a fresco, devendo os excedentes, viáveis, serem criopreservados.

3 - No momento da criopreservação os pacientes devem expressar sua vontade, por escrito, quanto ao destino dos embriões criopreservados, quer em caso de divórcio, doenças graves ou falecimento de um deles ou de ambos, quer por motivo de doação.

4 - Os embriões criopreservados com mais de cinco anos poderão ser descartados se esta for a vontade dos pacientes, e não apenas para pesquisas de células-tronco, conforme previsto na Lei de Biossegurança.

Introdução e História

Em meados da década de 1980, foi anunciada a primeira gravidez com embrião congelado e descongelado. Desde então, a maioria dos programas de Fertilização in Vitro (FIV) tem escolhido a criobiologia com a intenção de aumentar a chance de gravidez em um único ciclo de estimulação ovariana.

Como os protocolos de indução da ovulação têm aumentado o número de oócitos saudáveis recrutados, a responsabilidade de armazenar os oócitos tem crescido. Não é raro hoje, coletar 10 ou até mais oócitos maduros de uma mulher. Antes das técnicas de congelamento serem usadas no laboratório, a mulher que produzia muitos gametas tinha um número limitado de oócitos a serem inseminados ou risco de ter pré-embriões saudáveis descartados, porque somente três ou quatro pré-embriões poderiam ser transferidos com segurança para o útero após a fertilização.

Hoje tem sido demonstrado que o potencial de gravidez após o descongelamento, em alguns centros que realizam o procedimento, está quase igual ao de transferência de pré-embriões frescos. Além do mais, esses programas relatam taxa de gravidez clínica relativamente alta, tendo todos os embriões congelados, excedendo a 60%.

Objetivo do congelamento

A meta primária de um programa de congelamento é causar o menor dano possível no momento em que os gametas e embriões estiverem expostos a uma temperatura muito baixa. Os protocolos usados hoje em dia envolvem, essencialmente, técnicas de congelar-seco, que permitem a desidratação da célula para prevenir a formação de gelo intracelular.

A formação de cristais de gelo intracelular pode causar danos mecânicos aos oócitos e embriões. Esta é a razão pela qual as técnicas de congelamento são baseadas em agentes de crioproteção. Assim, quando as células humanas são colocadas em um meio contendo um agente de crioproteção intracelular, a água deixa imediatamente a célula graças à alta concentração extracelular de crioprotetores.

A taxa de penetração dos crioprotetores e água, depende da temperatura; o equilíbrio é ativado rapidamente em altas temperaturas. Por esta razão, oócitos e embriões são usualmente colocados no meio de crioproteção em temperatura ambiente. Entretanto, como alguns crioprotetores, a exemplo do dimethylsulfoxide (DMSO), são tóxicos em elevadas concentrações, ele é frequentemente usado em baixas temperaturas para reduzir os efeitos adversos.

Os crioprotetores são benéficos também por sua habilidade de baixar o ponto de congelamento das soluções, que podem manter-se descongeladas a - 5° até - 15°C por causa do super-resfriamento. Quando as soluções são super-resfriadas, as células não são desidratadas apropriadamente.

Para prevenir o super-resfriamento, um cristal de gelo é introduzido em um processo controlado chamado "seeding". Isto contribui para desidratação intracelular, onde a água deixa a célula para ativar o equilíbrio do ambiente extracelular. Se a taxa de resfriamento for muito rápida, a água não pode sair suficientemente rápido da célula e, como a temperatura continua caindo, o ponto é atingido onde a concentração da solução intracelular não é suficientemente alta para prevenir a formação de cristais de gelo.

Oócitos e embriões de mamíferos, que possuem proporções relativamente baixas da área de superfície de um único volume e contêm grande quantidade de água intracelular, são usualmente resfriadas em baixas taxas de diminuição de temperatura (0.1°- 1°C/min) para permitir adequada desidratação.

Com o uso dos crioprotetores, a permeabilidade da membrana é diferente no oócito, embrião e blastocisto. De certa maneira tem sido verificado que os diferentes agentes de crioproteção são mais convenientes em certos estágios do desenvolvimento dos gametas e embriões. DMSO e 1,2 propanodiol (PROH) são frequentemente usados para congelamento de embriões em estágio de pouca divisão celular e o propylene glycol (glicerol) é sempre usado para blastocistos. Os três agentes celulares têm um número razoável de pequenas moléculas que estão habilitadas para penetrar a membrana celular facilmente. Em adição a esses agentes, existem outras substâncias extracelulares que ajudam a desidratar e proteger as células. Uma das mais usadas é a sucrose, que possui grandes moléculas não permeáveis e ajuda a acelerar a desidratação da célula. A sucrose não pode ser usada sozinha e, com frequência, é acompanhada de crioprotetores intracelulares padrão.

Técnicas

Temperaturas e hidratação

Se o resfriamento terminar a uma temperatura relativamente alta (> -30°C), a célula então carrega mais gelo intracelular do que exposta por um longo período a baixas temperaturas (< -80°C). Para proteger a célula, o descongelamento deve ser realizado rapidamente para induzir a dispersão do gelo. Inversamente, amostras resfriadas a < - 80°C devem ser descongeladas mais lentamente para permitir a hidratação gradual. Se a água reentrar na célula rapidamente, a célula poderá inchar ou arrebentar. Desta maneira, amostras descongeladas são usualmente expostas progressivamente em diluições mais baixas de crioprotetores para removê-los gentilmente da célula.

Vitrificação

A vitrificação protege a célula, evitando a total formação de cristais de gelo. Para isso, são usadas soluções de crioproteção, que devem ser aumentadas para 40% (peso/volume) ou mais. Já que os crioprotetores são tóxicos em temperatura ambiente, os embriões são expostos em agentes a 0°C. As amostras são colocadas dentro do nitrogênio líquido (LN2) sem introduzir primeiro o "seed"; a viscosidade é tão grande que as soluções se solidificam como um estado de vitrificação.

Congelamento ultrarápido

A vitrificação e o congelamento ultrarápido são técnicas similares, pois se nenhum cristal de gelo se formar durante esse último processo, o resultado é a vitrificação. A diferença essencial é que as amostras são manuseadas em temperatura ambiente antes de ir para os banhos de gelo.

Com o congelamento ultrarápido, as amostras são expostas por curtos períodos (2-3 min) em concentrações relativamente altas de DMSO (3.5M) e sucrose (0.25M), seguido por uma colocação direta dentro do LN2 . Amostras são descongeladas rapidamente em banho Maria a 37° C, para remover o crioprotetor em um só passo.

Usando estas técnicas simples e rápidas, um grande número de crianças tem nascido. Estudos mostraram que com a evolução da técnica, após 1996 a taxa de sobrevivência chegou a 83% (com ao menos um blastômero intacto) e uma taxa de nascidos de 16%, com embriões clivados. A distribuição mitocondrial e as estruturas subcelulares globais são descritas como normais depois deste método de congelamento.

Estágios de congelamento

Oócitos

São facilmente congelados se possuem um núcleo. Estudos usando oócitos humanos em estágio de vesícula germinativa coletados de ciclos estimulados e não estimulados tem demonstrado que este estágio oferece boas taxas de sobrevivência e maturação depois do descongelamento.

Algumas anomalias foram descritas em oócitos maduros descongelados incluindo: ruptura da membrana plasmática; desorganização extensa do ooplasma; falta de núcleo; e frequente triploidia. No entanto, uma preocupação sobre o potencial de aneuploidia tem sido o primeiro fator a desencorajar a maioria dos programas clínicos a utilizar técnicas com oócitos maduros. Apesar desta preocupação, várias gravidezes têm sido reportadas depois do congelamento e descongelamento de oócitos maduros, entretanto poucas gravidezes têm sido descritas nos últimos 10 anos. Espera-se que o desenvolvimento do congelamento ultrarápido aumente os resultados futuros.

A habilidade de congelar oócitos humanos não fertilizados pode ser maravilhosa em alguns casos. Por exemplo: uma jovem mulher que está sendo tratada com radiação ou que tenha de passar por uma perda dos ovários, pode ser muito beneficiada. Similarmente, mulheres de mais idade que desejam estocar múltiplos oócitos, antes de perder a função ovariana, podem se valer desta tecnologia. Podem ser criados bancos de oócitos, da mesma forma que existem os bancos de espermatozoides para atender a população.

Pré-zigotos
Oócitos penetrados por espermatozoides representam uma opção completamente diferente de tratamento. O sucesso do congelamento nesse estágio celular tem abrangido mais que uma década e culminado em milhares de nascimentos. Esta ideia da perda do fuso no pré-zigoto, é em grande parte responsável pela sobrevivência e potencial de implantação.

É fácil determinar se o pré-zigoto sobreviveu ou não ao descongelamento. Quando a membrana não está intacta, a célula parece estar achatada e tem uma coloração escura. Após 15 a 24 horas em cultura, um oócito saudável com pró-núcleos, prossegue para a primeira clivagem. A divisão celular é o verdadeiro indicador da sobrevivência após o descongelamento; < 5% dos pré-zigotos que parecem estar saudáveis, falham após o descongelamento no seguimento deste padrão.

Apesar dos bons resultados, existem certas desvantagens. Como os pré-zigotos são congelados antes da clivagem, não existe nenhum padrão para os parâmetros morfológicos ajudarem na seleção. Consequentemente, os pré-zigotos com potencial de desenvolvimento pobre são algumas vezes congelados. Mas, a urgência em começar o congelamento pode ser inconveniente para alguns programas sem a equipe científica adequada.

Pré-embriões
O primeiro relato de nascimento após criopreservação e descongelamento originou-se de um pré-embrião congelado. Como acontecem com os oócitos em estágio de pró-núcleo, os pré-embriões em clivagem se desenvolvem após o descongelamento e contribuem para as taxas de gravidez aceitáveis. Quase que qualquer estágio de clivagem pode ser congelado com sucesso, desde a etapa de duas células até blastocisto. O congelamento de pré-embriões é conveniente porque, diferente dos pré-zigotos, não existe limite de tempo.

Além disso, a morfologia e a taxa de crescimento são conhecidas, permitindo a seleção de embriões totalmente viáveis. Está se tornando mais comum escolher os melhores embriões para transferência a fresco e congelar todos os outros com boa morfologia, somente após ter sido feita a seleção a fresco.

A sobrevida é algumas vezes difícil de avaliar, porque nem todos os blastômeros suportam os rigores do congelamento e descongelamento. Os blastômeros mortos podem estar espalhados entre os vivos, mas são facilmente removidos durante os procedimentos de Hatching. Em geral, um pré-embrião que possui mais de 50% de blastômeros viáveis no descongelamento é considerado um sobrevivente. Não existe evidência convincente de que a perda de um ou dois blastômeros seja danosa para os pré-embriões no desenvolvimento inicial. Apesar disso, tem sido relatado que pré-embriões humanos inteiramente intactos demonstram uma taxa de implantação mais elevada do que os parcialmente intactos.

Blastocistos

Os blastocistos têm sido objeto de grande interesse nos últimos anos. Vários estudos têm relatado o sucesso do congelamento, e muitos deles usaram sistemas de co-cultura para suportar o crescimento dos pré-embriões. A maioria dos relatos de gravidez evolutiva na faixa de 10 a 20% por transferência, surpreendentemente não demonstrou taxas significativamente mais altas, comparadas com as estatísticas norte-americanas em congelamento nos estágios iniciais, mas isso pode estar relacionado à transferência de um número menor de blastocistos ou a uma indicação de assincronia entre blastocisto e útero.

Estratégia para Criopreservação

O programa da Cornell, Nova York, EUA, desenvolveu a seguinte estratégia para determinar quando e como congelar vários embriões:

1) Nunca congele somente um embrião, a menos que a paciente tenha outros armazenados, criopreservados anteriormente ou não esteja fazendo uma transferência a fresco. A experiência de 12 anos indica que, os resultados da transferência de embriões únicos após congelamento e descongelamento, são muito pobres para justificar o custo para o paciente e a sobrecarga na equipe do laboratório. Tente congelar ao menos três embriões. Após o descongelamento os melhores resultados acontecem quando uma paciente transfere mais que dois embriões (taxa de gravidez clínica de 50% por transferência).

2) Cultive todos os pré-embriões julgados não aceitos para transferência e congelamento (com mais de 20% de fragmentação , < 6 células no dia 3) por três dias. Documente diariamente as observações do número de células e morfologia. Congele qualquer blastocisto em desenvolvimento nos dias 5 ou 6, se dois ou mais parecem saudáveis (não frequente).

Paciente com menos de 40 anos

1) Se a história prévia da paciente apresentar pré-embriões com boa morfologia, mantenha cinco a sete desses em cultura (dependendo da idade exata) e congele os restantes em estágio de pró-núcleo. Planeje congelar os restantes no dia 3, desde que a morfologia seja boa.

2) Se a história prévia da paciente apresentar pré-embriões com pobre morfologia ou se não há história prévia, então mantenha de sete a 10 embriões em cultura e congele os restantes no estágio de pró-núcleo. Planeje congelar pré-embriões adicionais nos dias 2 e 3 se dois ou mais embriões exibirem menos de 20% de fragmentação e clivagem normal.

3) Se a história prévia da paciente indicar morfologia pobre ou desenvolvimento embrionário lento, espere até o dia 3 antes de considerar o congelamento.

Paciente com mais de 40 anos

1) Não congele no estágio de pró-núcleos a menos que mais de 10 pré-zigotos estejam disponíveis e a história prévia apresente embriões com boa morfologia.

2) Congele após clivagem, somente se dois ou mais embriões possuírem excelente morfologia e clivagem regular, disponível sobre o número de embriões requeridos por transferência.

3) Considere a transferência de cinco embriões frescos em pacientes com 41 a 43 anos e seis embriões em pacientes com mais de 43 anos (com o consentimento do médico e da paciente). O número é permitido nos Estados Unidos da América, no Brasil, seguindo as normas do Conselho Federal de Medicina, não se pode ultrapassar o número de quatro embriões.